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　　猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）可引起对猫科动物致命的免疫介导性疾病，但目前临床上仍缺乏疫苗提供的有效保护。冠状病毒非结构蛋白nsp14和nsp16的甲基转移酶（MTase）活性会影响病毒毒力，但尚未有研究探讨影响酶活的nsp14与nsp16突变对FIPV毒力的作用。本研究基于前期构建的感染性克隆QS-79，通过定点突变nsp14（N415）和nsp16（D129）的MTase活性位点，成功拯救出两株分别命名为FIPV QS-79 dnsp14与dnsp16的突变毒株。突变株在体外表现出与亲本毒株相似的合胞体形成能力和生长动力学特征，并在巨噬细胞系中显著刺激干扰素及细胞因子表达上调。动物实验显示，dnsp14与dnsp16对猫的致病性明显降低，死亡率较野生型毒株下降75%。以高剂量（105 TCID50）和低剂量（104 TCID50）对猫进行免疫接种时，dnsp14在两种剂量下均能诱导高效价中和抗体（1:156），而dnsp16仅能诱导低水平中和抗体（1:64）；攻毒试验中dnsp14在两种免疫剂量下均可为50%的猫提供保护，而dnsp16未能提供有效保护。上述根据结果得出两种突变株对猫的致病性均减弱，且dnsp14比dnsp16能诱导更好的体液免疫反应与保护效果。

　　基于先前的研究，发现完全敲低nsp14或nsp16的MTase活性会导致病毒无法被拯救。为了制定获得能在细胞中复制的重组突变FIPV的策略，我们通过序列比对分析了FIPV 79-1146、PEDV CV777、MHV A59、TGEV WH-1、SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1、SARS-CoV Tor2和MERS-CoV EMC。发现nsp14和nsp16的MTase活性位点在多种冠状病毒中高度保守，最终确定nsp14第415位的天冬酰胺和nsp16第129位的天冬氨酸为突变靶点（图1A）。通过AlphaFold2在线网站对FIPV QS-79亲本株及dnsp14和dnsp16突变株进行了结构模拟，并使用AutoDock Vina预测了野生型和突变株的SAM结合口袋。如图所示，分子对接表明，nsp14 N415位点的侧链参与β-链的形成，并与邻近的α-螺旋共同形成一个稳定帽核结构（GPPPA）和SAM的口袋，促进nsp14参与RNA帽添加的甲基转移过程（图1B）。当第415位的氨基酸突变为丙氨酸时，nsp14 415位点与鸟苷磷酸基团上的氧原子之间的氢键形成被破坏（图1C）。nsp16的模拟结果为，第129位的天冬氨酸位于SAM结合口袋内更靠近m7G（cap-0结构）的位置，该位点与口袋内的其他氨基酸通过分子间相互作用来稳定SAM并将其朝向m7G定位（图1D和E）。为了验证这两个位点对酶活性的影响，我们表达了FIPV QS-79 nsp16、nsp14、nsp10、nsp14 N415A位点突变和nsp16 D129A位点突变蛋白，然后使用相应的底物测量了MTase活性。结果显示，nsp14 N415和nsp16 D129突变的甲基转移酶活性大幅度的降低（图1F）。这些结果证明nsp14 N415位点和nsp16 D129位点是关键的MTase活性位点；同时，nsp14和nsp16参与了FIPV QS-79 RNA帽结构的甲基化。

　　通过体外CRISPR-Cas9技术操作病毒基因组，以设计QS-79 nsp14和QS-79 nsp16酶活性缺失的重组突变体。首先，咱们进行了sgRNA体外转录和琼脂糖凝胶电泳鉴定。片段大小正确，完整性和纯度得到确认（图2A）。使用Cas9酶和sgRNA消化QS-79 BAC质粒，成功产生线性化载体和包含目标基因的片段（图2B）。通过融合PCR进行定点突变，成功产生了两个基因片段，一个用于nsp14 N415A位点突变，一个用于nsp16 D129A位点突变（图2C和D）。通过转化将突变片段和BAC质粒进行重组结合，并对所得质粒进行测序。测序结果为，nsp14的第415位和nsp16的第129位均突变为编码丙氨酸，表明dnsp14 BAC和dnsp16 BAC构建成功（图2E）。将dnsp14 BAC、dnsp16 BAC和阳性对照QS-79 BAC通过转染插入HEK-293T细胞，24小时后，用细胞上清液感染CRFK细胞36小时。进行了蛋白质印迹和间接免疫荧光实验，并成功检测到FIPV病毒N蛋白（图2F和G），证明dnsp14和dnsp16突变株已在CRFK细胞中成功拯救。

　　3、dnsp14和dnsp16在体外未表现出增殖能力减弱但诱导增强的免疫反应

　　为了表征突变株dnsp14和dnsp16在体外的生物学特性，我们以0.01的感染复数（MOI）用dnsp14、dnsp16和QS-79感染CRFK和Fcwf-4细胞，并每12小时收集病毒细胞上清液进行TCID50测定。生长动力学曲线表明，突变株与亲本株在感染两种细胞系后，各时间点的增殖趋势、病毒滴度和峰值病毒滴度均无显著差异（图3A和B）。病毒合胞体形成实验也显示，突变株与亲本株感染的合胞体形成能力无显著差异（图3C）。以MOI为0.01的剂量感染Fcwf-4细胞并总共培养24小时，提取细胞RNA进行实时PCR检测。结果显示，dnsp14和dnsp16诱导了显著更高水平的IFN-β和ISG15的mRNA表达（图3D和E）。此外，观察到感染dnsp16突变株的细胞中TNF-α的表达明显地增加，而dnsp14突变株与QS-79亲本株感染后的TNF-α表达水平无显著差异（图3F）。这些根据结果得出，QS-79 nsp14 N415A位点突变和nsp16 D129A位点突变不影响病毒在体外的增殖能力，但重组病毒能诱导更强的免疫反应。

　　使用成年猫的口服攻毒模型来评估突变株的体内致病性（图4A）。将十六只健康成年猫随机分为四组，每组四只；三个实验组中的猫分别口服接种1 mL 105.5 TCID50/mL的dnsp14、dnsp16和QS-79，模拟组猫口服接种1 mL无菌PBS。基于食欲、精神情况、眼鼻分泌物、粪便排泄和神经系统症状进行临床评分。实验结果为，感染QS-79株的成年猫体温升高和体重减轻，而dnsp14和dnsp16感染组的猫在整个试验期间没再次出现持续性发热（图4B和C）。dnsp14组猫的体重在感染1周后轻微下降，并在后期逐渐恢复。dnsp16组猫的体重没下降，模拟组猫没再次出现体温升高或体重减轻。QS-79组成年猫的临床症状在感染后持续恶化，表现为精神抑郁、食欲不振、眼鼻有炎性分泌物以及排泄减少。dnsp14组猫表现出食欲不振、精神抑郁以及体重减轻，但这些临床表现随着体重的恢复而消失，其总体临床评分明显低于QS-79感染组猫；同时，dnsp16组猫的临床症状与模拟组猫没有差异，未发现明显的FIP临床症状（图4D）。淋巴细胞减少是FIP的典型特征，血常规检验测试结果为，QS-79感染组的淋巴细胞数量在1周后降至基线感染组以及模拟组的淋巴细胞数量在整个试验期间均在正常范围内波动（图4E）。中和抗体检测结果为，感染QS-79、dnsp14和dnsp16的成年猫能诱导中和抗体水平升高。感染dnsp14诱导的抗体水平与QS-79感染无显著差异，感染dnsp16诱导的抗体水平低于其他两个实验组，模拟组未产生中和抗体（图4F）。检测了先天免疫基因的表达，如IFN-β、ISG15和IFITM1，结果为与qs-79感染后的高表达相比，dnsp14和dnsp16感染降低了这些基因的表达（图S1）。死亡率结果为，QS-79组的所有成年猫在9周内死亡，三只猫在感染后2周内死亡，最后一只死亡的猫病程较长，在感染后第59天死亡。dnsp14组的一只猫在攻毒后第36天死亡，dnsp16组的一只猫在攻毒后第44天死亡，模拟组无猫死亡（图4G）。分别在第36天、第44天、第59天和第59天对dnsp14、dnsp16、QS-79和MOCK组进行解剖和病理学检查。根据解剖和病理学检查，QS-79组的肉眼病变明显，在肝脏、肾脏和脾脏观察到典型的FIP非干酪样肉芽肿，dnsp14和dnsp16组出现纤维蛋白性浆膜炎和化脓性肉芽肿，肾脏无明显病变，模拟组的肝脏、肾脏和脾脏无明显病变（图4I）。苏木精-伊红（H&E）染色显示上述病变处有显著的炎性细胞浸润和细胞坏死，但dnsp14和dnsp16组的病变严重程度低于QS-79组，模拟组组织形态完整，无炎症浸润（图4J）。免疫组化结果显示，在QS-79感染猫的肝脏、脾脏和肾脏中检测到FIPV N蛋白，证明QS-79感染猫的器官病变是由FIPV引起的。在dnsp14和dnsp16感染猫的肝脏和脾脏中也观察到表明发病区域的棕色染色信号，肾脏无显著阳性信号，模拟组任何猫均无阳性信号（图4K）。组织器官病毒载量检测显示，dnsp16组的病毒载量明显低于QS-79组和dnsp14组，仅在脾脏和肺部检测到病毒颗粒（图4H）。这些根据结果得出，两种突变株在体内成功减毒。

　　突变株在105.5 TCID50剂量下仍有25%的死亡率，因此通过降低免疫剂量尽可能提高突变株免疫的安全性。对于dnsp14和dnsp16突变株，设计了高剂量（105 TCID50）和低剂量（104 TCID50）免疫组，相应的猫通过两次口服剂量和一次皮下注射进行免疫，每次间隔21天（图5A）。对照组猫以相同方式免疫1 mL无菌PBS。结果为，dnsp14的死亡率不具剂量依赖性，在高剂量和低剂量免疫后均有三分之一的猫死亡（图5B）。dnsp14突变株在高剂量免疫三次后，在所有猫中诱导了1:1024的中和抗体滴度。在低剂量免疫三次后，免疫猫的平均抗体滴度超过1:256，但有一只猫在三次免疫后未产生中和抗体（图5D）。dnsp16突变株在高剂量下死亡率为25%，而在低剂量下免疫的猫100%存活（图5C）。dnsp16突变株在两种免疫剂量下诱导的中和抗体水平均低于dnsp14，并且低剂量免疫的猫中有一半未产生中和抗体（图5E）。总之，尽管dnsp14突变株在高和低免疫剂量下均能诱导强烈的体液免疫反应并产生高水平中和抗体，但其免疫安全性仍需提高；低剂量免疫dnsp16突变株的成年猫存活率为100%，但该突变株在该剂量下诱导的体液免疫反应较弱，仅产生低水平中和抗体。

　　6、50%的猫在dnsp14免疫组中能够抵抗高致病性毒株QS-79的攻毒

　　在首次免疫后第80天，所有猫均用1 mL 105.5 TCID50/mL QS-79进行攻毒试验（每组n=4）。结果显示，PBS免疫组、dnsp14高剂量免疫组和dnsp14低剂量免疫组的猫在感染后立即出现体温升高和体重减轻的临床症状，PBS组猫的临床症状最严重，所有猫在感染期间均出现发热（图6A和B）。临床评分结果显示，PBS组中50%的猫在感染中期出现继发性细菌感染，所有猫在死亡当天出现严重的FIP症状，包括呼吸窘迫和后肢瘫痪，而dnsp14免疫组的动物均出现较轻的症状，未出现神经系统症状或呼吸窘迫。dnsp14低剂量和高剂量免疫分别将成年猫的发病时间推迟了1周和2周（图6C）。PBS组的所有猫在攻毒后49天内死亡，而所有dnsp14免疫组中50%的动物受到保护，免于高致病性毒株QS-79的侵害，除了低剂量组中一只未产生抗体的猫在攻毒后第10天死亡，其他dnsp14免疫的成年猫则表现出延长的存活期（图6D）。血常规和生化分析显示，所有免疫了dnsp14突变株的猫在攻毒后均表现出淋巴细胞水平的短暂下降，fSAA水平在攻毒后逐渐升高，其中低剂量免疫组在感染后恢复更快（图6E）。淋巴细胞计数在攻毒后持续下降，fTBIL、fALT和fAST水平在攻毒后持续升高，fAST水平在感染第一周结束时远高于正常范围（图6F至I）。dnsp14免疫组猫的fALT和fAST水平在攻毒后升高了3-4周，然后逐渐回到正常状态。PBS组的生化和血常规检测异常是不可逆的。对实验组猫进行了病理学分析和病毒载量测量。解剖显示，dnsp14免疫组猫在病毒攻毒后，肾脏出现典型的FIPV感染肉芽肿病变（白色箭头所示），而其他器官的病变严重程度低于PBS免疫猫（图6J）。通过H&E染色，在所有三个实验组猫的肝脏、肾脏和脾脏中均观察到显著的炎性细胞浸润。dnsp14高剂量免疫组猫在攻毒后肝脏未显示显著的FIP病变特征，但H&E染色显示肝组织中出现肝细胞肿胀和胞质空泡化（图6K）。免疫组化结果为，所有三个实验组中肝脏、肾脏和脾脏的病理损伤均由FIPV感染从而引起（图6L）。dnsp14高剂量免疫攻毒组和PBS免疫攻毒组的器官病毒载量非常明显升高。dnsp14高剂量免疫攻毒组在盲肠、大脑和小脑中的病毒载量低于检测限，在肝脏、脾脏、肺和淋巴结中的病毒载量较低（图6M）。上述数据表明，dnsp14突变株可以诱导高水平的中和抗体并为成年猫提供部分保护。以不同免疫剂量施用dnsp14突变株在成年猫中提供了一致的保护，50%的成年猫能抵抗高致病性毒株QS-79，而死亡的50%的猫其由FIPV感染从而引起的临床表现和病理损伤得到缓解，并且存活期延长。

　　在首次免疫后第80天，所有猫均用1 mL 105.5 TCID50/mL QS-79进行攻毒试验。结果显示，不同剂量dnsp16免疫在注射后立即引起体温升高和持续性发热，猫的体重在1个月内降至其初始体重的80%（图7A和B）。食欲不振、抑郁、呼吸困难和共济失调等临床症状与PBS免疫组无显著差异，临床评分在1个月内持续增加（图7C）。高剂量免疫组和低剂量免疫组的猫均在30天内自然死亡（图7D）。三个实验组之间的死亡率或死亡时间无显著差异。所有三个实验组的猫在攻毒后均显示淋巴细胞水平下降，两个dnsp16免疫组的猫下降速度比PBS组慢。并且fSAA、fTBIL、fALT和fAST水平在感染QS-79后持续升高（图7E至I）。对死亡猫的病理剖检显示，dnsp16免疫后攻毒引起的器官病变很明显，肝脏、肾脏和脾脏出现典型的FIP肉芽肿病变（图7J）。低剂量dnsp16免疫后的攻毒组肝脏和肾脏病变最明显，病变部位的H&E染色显示所有组织均出现严重的病理病变。肉芽肿以坏死组织为中心，周围结缔组织有大量炎症浸润（图7K）。此外，对病变部位进行了免疫组化检测，所有切片均显示强阳性信号（图7L）。病毒载量评估显示，与PBS免疫组相比，免疫了dnsp16突变株的成年猫在肝脏、脾脏、肺、肾脏、淋巴结、盲肠和大网膜中的病毒水平更高（图7M）。不同dnsp16免疫剂量的攻毒保护实验根据结果得出，低水平的中和抗体无法阻断FIPV感染。攻毒后更高的临床评分、更明显的器官病变和更高的病毒载量表明，dnsp16疫苗接种可能诱导成年猫的疾病增强。

　　本研究成功构建并拯救了在nsp14 N7-MTase活性位点（N415）和nsp16 2-O-MTase活性位点（D129）发生突变的FIPV毒株。突变株dnsp14和dnsp16在成年猫体内的致病性均较低，其中dnsp16更不稳定。dnsp14在免疫后诱导高水平中和抗体的产生，并能针对强毒FIPV攻毒提供50%的保护，而dnsp16在免疫后仅诱导低水平中和抗体的产生，并且不能防御FIPV攻毒。本研究成功构建了一种减毒、能在宿主体内有效复制并能提供部分保护以抵抗强毒亲本病毒的候选疫苗，为开发针对猫冠状病毒nsp14/nsp16 MTase的减毒活疫苗提供了参考。